???? Kary Mullis博士也許并沒有想到，他發(fā)明的PCR技術(shù)能夠在未來三十年保持長盛不衰。這不僅要歸功于DNA聚合酶的發(fā)展，也要歸功于PCR儀的不斷升級。如今，反應(yīng)效率提高，反應(yīng)體積減少，使得PCR逐漸應(yīng)用在更廣泛的領(lǐng)域。選購PCR儀，似乎并不是一件難事。然而，對于一些關(guān)鍵的參數(shù)，你真的了解它們的意義嗎？
現(xiàn)在，快速PCR已成為一種潮流。反應(yīng)時間從90分鐘縮短到30分鐘，絕對是受歡迎的，畢竟誰也不想在預(yù)約PCR儀時排隊等太久。溫度循環(huán)是所有PCR的基礎(chǔ)。儀器的變溫速率將決定PCR運行的整體速度。毫無疑問，變溫越快，PCR運行也越快。宣傳資料往往也會首先展示最高變溫速率以暗示PCR儀運行速度更快。因此，在拿到參數(shù)表時，我們第一時間會留意變溫速率，也就是升降溫速率。
不過，如果大家留心看，通常會發(fā)現(xiàn)ramp rate前面還會有一個Max，這說明制造商公布的是最大變溫速率。最大模塊變溫速率（maximum block ramp rate）表示模塊變溫速率的極限峰值。在PCR運行過程中，上述最大性能只在極短的時間內(nèi)可達(dá)到，那種掐著秒表來計算變溫速率的方法是不可取的。因此有誠意的制造商還會公布平均模塊變溫速率（average block ramp rate），表示在較長的變溫范圍內(nèi)溫度變化的速率。這個參數(shù)沒那么炫目，但更具參考意義，具有比較價值。
當(dāng)然，樣品的變溫速率可沒有模塊那么高。這就好比在爐子上燒水，爐子很快就達(dá)到100oC以上，但水可能只有50oC。模塊的熱量傳遞到樣品還需要一定的滯后時間。因此，只根據(jù)模塊溫度編程而不考慮樣品體積的變溫速率并不能算準(zhǔn)確。Applied Biosystems在這一點上就很周道，提供了另一種參數(shù)，平均樣本變溫速率(average sample ramp rate)或者最大樣品變溫速率（maximum sample ramp rate）。這個參數(shù)能反應(yīng)儀器根據(jù)體積來控制樣品達(dá)到設(shè)置溫度、遵循預(yù)設(shè)的實驗方案運行的真實能力，更有效地評估PCR儀的真實性能。
對于PCR反應(yīng)而言，最重要的莫過于溫度控制的準(zhǔn)確性。由于PCR是一個幾何級數(shù)擴增的過程，不論是變性、退火還是延伸都需要準(zhǔn)確控制溫度，對退火而言溫控顯得尤為重要。有時，退火溫度相差1oC，就能帶來迥然不同的結(jié)果。目前，市場上的大多數(shù)PCR儀采用Peliter元件加熱，溫度準(zhǔn)確性在±0.2oC左右。
溫度控制算法的精確性無疑會影響溫度控制的精確。前面提到的模塊熱過沖，需要非常豐富的經(jīng)驗，精確的算法才可使不同體積的樣本達(dá)到穩(wěn)定的設(shè)置點溫度且無過沖及相關(guān)的負(fù)面效應(yīng)。
對于96孔板PCR儀來說，另一個重要的參數(shù)是溫度均一性，這指的是各孔之間的溫度差異。均勻擴增反應(yīng)板各孔的能力至關(guān)重要，在實驗設(shè)計時常常被忽略。如果孔間的溫度條件不一致，那么我們自然無法通過比較兩個不同位置的反應(yīng)孔數(shù)據(jù)，而得到可靠的結(jié)論。大多數(shù)儀器的溫度均一性在±0.3到±0.5oC之間。比如，Eppendorf的Mastercycler Pro S，在20-72oC時，均一性≤ ±0.3oC，在95oC，均一性≤ ±0.4oC。
對于梯度PCR而言，溫度準(zhǔn)確性的要求似乎更高。梯度PCR儀最先由Eppendorf公司在1998年研發(fā)成功推向市場（Mastercycler Gradient）。通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴增，從而一次反應(yīng)就可以篩選出最適合的退火溫度，優(yōu)化實驗，在節(jié)約成本的同時也節(jié)約了時間。
傳統(tǒng)的梯度PCR儀的加熱模塊由分別控溫的2個Peltier元件組成，對它們設(shè)置不同的溫度，通過熱傳導(dǎo)可形成溫度梯度。不過，由于均勻的金屬加熱模塊兩端設(shè)置的高溫和低溫之間的熱學(xué)相互作用，無法實現(xiàn)真正的線性梯度。實際上，均勻的金屬加熱模塊上的溫度更多呈S形曲線而非線性梯度，列間的溫度差異不一致使其難以確定優(yōu)化后的真實退火溫度，尤其是在優(yōu)化難以處理的試驗時。
雖說PCR儀已逐漸設(shè)計成個人化的儀器，但真的是實驗室中人手一臺，顯然并不太實際。實驗室中通常有多個課題，每個人的應(yīng)用也各不相同，因此PCR儀最好能滿足不同的需求。96孔模塊是大多數(shù)人的選擇，但未來有什么樣的需求，當(dāng)下并不清楚。抱著開放的心態(tài)，選擇一臺靈活的PCR儀，也許是明智的。
性能要高端，操作可得簡單，這也是PCR儀選購時一個重要的考慮因素。畢竟，實驗室里用戶的水平參差不齊，既有經(jīng)驗豐富的老手，也有剛剛?cè)腴T的新手。操作直觀、輕松編程，相信是每個人的愿望。
幸運的是，如今的制造商在設(shè)計時都考慮到這一點，紛紛采用碩大的觸摸屏。有些人可能還不太習(xí)慣，但大多數(shù)人享受著這種隨便點點就能設(shè)置好程序的過程。
遠(yuǎn)程訪問也增強了用戶體驗，它讓用戶能夠通過智能手機或平板電腦，調(diào)整操作并查看初步結(jié)果。
隨著PCR的應(yīng)用越來越廣泛，人們也希望將PCR儀帶出實驗室，帶到診所和田間。一些制造商也推出了便攜的PCR儀。不過，在大多數(shù)情況下，儀器還是擺在擁擠的實驗臺上。而且，一些必要的組件是不可少的，比如加熱元件、電源等。因此，高性能的PCR儀還是占有一定的體積。不過，如今連測序儀都跟U盤一般大了，還有什么是不可能的呢。
過去三十年，PCR已經(jīng)帶給了我們很多的驚喜。未來，儀器性能會更高，操作會更簡便，功能會更多樣，只是，選擇會更困難。擦亮雙眼，看看你真的需要什么，再做決定吧。