文章來源：解螺旋·醫(yī)生科研助手
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·導語·
好的引物會讓PCR實驗成功一半，因而，引物設計一直都是PCR非常重要的環(huán)節(jié)。PrimerPremier5和Oligo7這兩款軟件想必是備受科研汪們推崇的引物設計軟件?？墒菍τ趹邪┩砥诘男◆~而言，下載這兩款軟件也是一件非常麻煩的事情。有木有比這兩款軟件更簡單粗暴的引物獲取方法呢？在這里小魚特地給大家推薦3款簡單實用的在線PCR引物設計軟件，讓你分分鐘搞定PCR引物。
No.1 ：NCBI的Primer-Blast
推薦指數(shù)：五顆星
理由：這個工具整合了目前流行的Primer3軟件，且加上NCBI的Blast進行引物特異性的驗證；可以針對某一特定剪接變異體基因來設計引物。
網(wǎng)址鏈接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/或者直接從Blast主頁（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）上找到。
Primer-Blast的界面包括4個部分：PCRTemplate（模板區(qū)），Primer Parameters（引物區(qū)），Exon/intron Selection（外顯子內含子設置）和specificity check（特異性驗證區(qū)）。
1、設計引物
2、驗證引物好壞
3、外顯子內含子（Exon/intron）
如果設計的引物是跨內含子和外顯子的交界處，可在此處設置成為Primer must span an exon-exon junction。外顯子的匹配堿基數(shù)和內含子的長度等設置一般選擇默認。
4、特異性（Specificitycheck）
在specificity check區(qū)，選擇設計引物或驗證引物時的目標數(shù)據(jù)庫和物種。這一步是比較重要的。
這里提供了7種數(shù)據(jù)庫：
RefSeq mRNA，Genome (referenceassemblies from selected organisms)，RefSeqrepresentative genomes，RefSeq RNA(refseq_rna)，nr (the standard non-redundant database)，Genome (chromosomesfrom all organisms)和custom。
前兩個數(shù)據(jù)庫是經(jīng)過專家注釋的數(shù)據(jù)，這樣可以給出更準確的結果。特別是，當你用NCBI的參考序列作為模板和參考序列數(shù)據(jù)庫作為標準來設計引物時，Primer-BLAST可以設計出只擴增某一特定剪接變異體基因的特異引物。
最后建議用oligo6或primer5驗證引物自身的特性：發(fā)夾結構、引物自身二聚體、錯配和引物間二聚體，△G的絕對值。
No.2 ：Primer3 Plus
推薦指數(shù)：五顆星
理由：嚴格的qPCR引物設計一般要求其中一條引物要跨外顯子，最好在3‘端設計引物，產(chǎn)物的長度在300bp以內等。本在線軟件可滿足qPCR引物設計的要求。
網(wǎng)址鏈接：http://www.primer3plus.com/
1、選擇Run latest Versionof Primer3Plus，就進入了設計引物的主頁面，合理的使用<>，［］，｛｝符號使引物設計符合自己的要求，大家可以在具體實戰(zhàn)中，深入體會這幾個符號帶來的方便。
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2、避免多個重復堿基出現(xiàn)，避免4個或超過4個G出現(xiàn)在引物序列中。按照熒光定量引物要求設置參數(shù)，如產(chǎn)物長度：不應該超過400bp，最好100-150bp；GC％：30％-70%，最好45%－55%；引物長度：18-25bp，最好22-24bp；TM值：58-60℃，最好60℃；3’端：3’端至少4個堿基保守，最好為T，C，G。
3、點擊右上放綠色按鈕
，可獲得若干對引物，并按照5’到3’的順序，包含了引物和產(chǎn)物的一些基本參數(shù)。可以根據(jù)熒光定量引物要求，盡量選擇G、C結尾的引物合成，如下圖中紅框所示，還可以在序列圖中看到引物的位置。
4、設計好引物后，我們要進行NCBI blast 引物驗證，進入http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
5、點擊Basic BLAST中的nucleotideblast選項，在下面框中，按照5’－3’順序，分別輸入上游引物和下游引物，上下游引物之間間隔20個以上n。
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6、選擇物種數(shù)據(jù)庫，如Human，Mouse或者Others（如果是非人和非小鼠物種）。
7、選擇Somewhat similar sequences(blastn)
8、點擊Algorithm parameters, 在Expect threshold 輸入1000，在Word Size 輸入7。Word size不是字體大小的意思，應該理解為讀長，按照7個一組核苷酸序列放到GeneBank中進行比對。
9、點擊BLAST，開始比對，出現(xiàn)結果。顏色代表得分，選擇引物的原則是：列表中大部分是目的基因，說明引物特異性高；但是可能物種不同，說明該基因在不同物種中保守。
No.3 ：Primerbank
推薦指數(shù)：五顆星
理由：哈佛大學的一個qPCR引物數(shù)據(jù)庫，目前有超過20萬條引物，涵蓋了人和小鼠大部分已知的基因。根據(jù)網(wǎng)站上對兩萬多對引物的驗證結果，引物有效率為82.7%。盡量選擇這種驗證過的qPCR引物，qPCR品質比較有保障。
網(wǎng)址：http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
搜索類型這里，可以根據(jù)GenBank accession、NCBI protein accession、NCBI gene ID、primerbank ID、NCBI gene symbol以及keyword六個選項進行搜索。以小鼠的beta-actin為例。
1、首先，到NCBI上找出β-actin的gene ID，如圖，選擇gene,輸入beta-actin：
點擊右邊的分類musmusculus：
結果就出來了，小鼠beta-actin的NCBI gene ID是11461，而actb則是小鼠beta-actin的NCBI gene symbol。
2、把11461輸入到primerbank里面試試：
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在這個結果上我們可以看到beta-actin的NCBI gene ID、GenBank accession、NCBI protein accession、coding DNA length等信息。
3、若是改輸入beta-actin的NCBI gene symbol：actb，也可以得到相同的結果，往下拉我們還能看到經(jīng)過驗證的引物：
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4、點進去可以看到溶解曲線、電泳結果等信息：
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