文章來(lái)源:解螺旋·醫(yī)生科研助手
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·導(dǎo)語(yǔ)·
好的引物會(huì)讓PCR實(shí)驗(yàn)成功一半,因而,引物設(shè)計(jì)一直都是PCR非常重要的環(huán)節(jié)。PrimerPremier5和Oligo7這兩款軟件想必是備受科研汪們推崇的引物設(shè)計(jì)軟件??墒菍?duì)于懶癌晚期的小魚(yú)而言,下載這兩款軟件也是一件非常麻煩的事情。有木有比這兩款軟件更簡(jiǎn)單粗暴的引物獲取方法呢?在這里小魚(yú)特地給大家推薦3款簡(jiǎn)單實(shí)用的在線PCR引物設(shè)計(jì)軟件,讓你分分鐘搞定PCR引物。
No.1 :NCBI的Primer-Blast
推薦指數(shù):五顆星
理由:這個(gè)工具整合了目前流行的Primer3軟件,且加上NCBI的Blast進(jìn)行引物特異性的驗(yàn)證;可以針對(duì)某一特定剪接變異體基因來(lái)設(shè)計(jì)引物。
網(wǎng)址鏈接:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/或者直接從Blast主頁(yè)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上找到。
Primer-Blast的界面包括4個(gè)部分:PCRTemplate(模板區(qū)),Primer Parameters(引物區(qū)),Exon/intron Selection(外顯子內(nèi)含子設(shè)置)和specificity check(特異性驗(yàn)證區(qū))。
1、設(shè)計(jì)引物
2、驗(yàn)證引物好壞
3、外顯子內(nèi)含子(Exon/intron)
如果設(shè)計(jì)的引物是跨內(nèi)含子和外顯子的交界處,可在此處設(shè)置成為Primer must span an exon-exon junction。外顯子的匹配堿基數(shù)和內(nèi)含子的長(zhǎng)度等設(shè)置一般選擇默認(rèn)。
4、特異性(Specificitycheck)
在specificity check區(qū),選擇設(shè)計(jì)引物或驗(yàn)證引物時(shí)的目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)和物種。這一步是比較重要的。
這里提供了7種數(shù)據(jù)庫(kù):
RefSeq mRNA,Genome (referenceassemblies from selected organisms),RefSeqrepresentative genomes,RefSeq RNA(refseq_rna),nr (the standard non-redundant database),Genome (chromosomesfrom all organisms)和custom。
前兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)是經(jīng)過(guò)專家注釋的數(shù)據(jù),這樣可以給出更準(zhǔn)確的結(jié)果。特別是,當(dāng)你用NCBI的參考序列作為模板和參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)設(shè)計(jì)引物時(shí),Primer-BLAST可以設(shè)計(jì)出只擴(kuò)增某一特定剪接變異體基因的特異引物。
最后建議用oligo6或primer5驗(yàn)證引物自身的特性:發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物自身二聚體、錯(cuò)配和引物間二聚體,△G的絕對(duì)值。
No.2 :Primer3 Plus
推薦指數(shù):五顆星
理由:嚴(yán)格的qPCR引物設(shè)計(jì)一般要求其中一條引物要跨外顯子,最好在3‘端設(shè)計(jì)引物,產(chǎn)物的長(zhǎng)度在300bp以內(nèi)等。本在線軟件可滿足qPCR引物設(shè)計(jì)的要求。
網(wǎng)址鏈接:http://www.primer3plus.com/
1、選擇Run latest Versionof Primer3Plus,就進(jìn)入了設(shè)計(jì)引物的主頁(yè)面,合理的使用<>,[],{}符號(hào)使引物設(shè)計(jì)符合自己的要求,大家可以在具體實(shí)戰(zhàn)中,深入體會(huì)這幾個(gè)符號(hào)帶來(lái)的方便。
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2、避免多個(gè)重復(fù)堿基出現(xiàn),避免4個(gè)或超過(guò)4個(gè)G出現(xiàn)在引物序列中。按照熒光定量引物要求設(shè)置參數(shù),如產(chǎn)物長(zhǎng)度:不應(yīng)該超過(guò)400bp,最好100-150bp;GC%:30%-70%,最好45%-55%;引物長(zhǎng)度:18-25bp,最好22-24bp;TM值:58-60℃,最好60℃;3’端:3’端至少4個(gè)堿基保守,最好為T(mén),C,G。
3、點(diǎn)擊右上放綠色按鈕
,可獲得若干對(duì)引物,并按照5’到3’的順序,包含了引物和產(chǎn)物的一些基本參數(shù)??梢愿鶕?jù)熒光定量引物要求,盡量選擇G、C結(jié)尾的引物合成,如下圖中紅框所示,還可以在序列圖中看到引物的位置。
4、設(shè)計(jì)好引物后,我們要進(jìn)行NCBI blast 引物驗(yàn)證,進(jìn)入http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
5、點(diǎn)擊Basic BLAST中的nucleotideblast選項(xiàng),在下面框中,按照5’-3’順序,分別輸入上游引物和下游引物,上下游引物之間間隔20個(gè)以上n。
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6、選擇物種數(shù)據(jù)庫(kù),如Human,Mouse或者Others(如果是非人和非小鼠物種)。
7、選擇Somewhat similar sequences(blastn)
8、點(diǎn)擊Algorithm parameters, 在Expect threshold 輸入1000,在Word Size 輸入7。Word size不是字體大小的意思,應(yīng)該理解為讀長(zhǎng),按照7個(gè)一組核苷酸序列放到GeneBank中進(jìn)行比對(duì)。
9、點(diǎn)擊BLAST,開(kāi)始比對(duì),出現(xiàn)結(jié)果。顏色代表得分,選擇引物的原則是:列表中大部分是目的基因,說(shuō)明引物特異性高;但是可能物種不同,說(shuō)明該基因在不同物種中保守。
No.3 :Primerbank
推薦指數(shù):五顆星
理由:哈佛大學(xué)的一個(gè)qPCR引物數(shù)據(jù)庫(kù),目前有超過(guò)20萬(wàn)條引物,涵蓋了人和小鼠大部分已知的基因。根據(jù)網(wǎng)站上對(duì)兩萬(wàn)多對(duì)引物的驗(yàn)證結(jié)果,引物有效率為82.7%。盡量選擇這種驗(yàn)證過(guò)的qPCR引物,qPCR品質(zhì)比較有保障。
網(wǎng)址:http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
搜索類型這里,可以根據(jù)GenBank accession、NCBI protein accession、NCBI gene ID、primerbank ID、NCBI gene symbol以及keyword六個(gè)選項(xiàng)進(jìn)行搜索。以小鼠的beta-actin為例。
1、首先,到NCBI上找出β-actin的gene ID,如圖,選擇gene,輸入beta-actin:
點(diǎn)擊右邊的分類musmusculus:
結(jié)果就出來(lái)了,小鼠beta-actin的NCBI gene ID是11461,而actb則是小鼠beta-actin的NCBI gene symbol。
2、把11461輸入到primerbank里面試試:
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在這個(gè)結(jié)果上我們可以看到beta-actin的NCBI gene ID、GenBank accession、NCBI protein accession、coding DNA length等信息。
3、若是改輸入beta-actin的NCBI gene symbol:actb,也可以得到相同的結(jié)果,往下拉我們還能看到經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的引物:
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4、點(diǎn)進(jìn)去可以看到溶解曲線、電泳結(jié)果等信息:
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