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基因編輯CRISPR-Cas9研究獲新成果

日期: 2017-11-13
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科學(xué)網(wǎng)11月9日上海訊(記者黃辛)今天,復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、遺傳工程國家重點實驗室黃強(qiáng)課題組與盧大儒課題組合作的關(guān)于基因編輯系統(tǒng)CRISPR-Cas9的研究成果在線發(fā)表于國際知名學(xué)術(shù)期刊《自然·通訊》(Nature Communications)。該成果用冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)方法解析了CRISPR-Cas9的DNA剪切活性結(jié)構(gòu),在CRISPR-Cas9的DNA剪切機(jī)理研究方面取得了重要進(jìn)展。

基因編輯CRISPR-Cas9研究獲新成果

目前,基于細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)展出的CRISPR-Cas9技術(shù)已成為革命性的基因編輯工具,這一“基因魔剪”可以方便地對基因組DNA進(jìn)行高效、特異性的切割編輯,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。為了解該系統(tǒng)的DNA剪切機(jī)理、指導(dǎo)系統(tǒng)的優(yōu)化,過去幾年,眾研究機(jī)構(gòu)陸續(xù)解析了多個“Cas9-sgRNA-DNA靶鏈”的三元復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。然而,這些復(fù)合物結(jié)構(gòu)并沒有完全揭示出真正的DNA剪切活性構(gòu)象,人們對CRISPR-Cas9如何通過HNH與RuvC核酸酶域切割DNA單鏈的分子機(jī)制還很不明確。因此,獲得CRISPR-Cas9的剪切活性結(jié)構(gòu)成為了揭示該系統(tǒng)DNA剪切機(jī)理的關(guān)鍵。

針對上述研究問題,黃強(qiáng)與盧大儒研究團(tuán)隊早在2014年就考慮采用冷凍電鏡方法來解決。他們首先構(gòu)建了釀膿鏈球菌Cas9酶 (SpCas9)、sgRNA和DNA的三元復(fù)合物,然后用冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)方法解析該復(fù)合物的溶液結(jié)構(gòu),獲得了一個5.2埃分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu) 。

復(fù)合物結(jié)構(gòu)的原子模型顯示,在已解析的所有結(jié)構(gòu)中,該復(fù)合物的HNH酶活性中心最接近DNA鏈的切割位點;分子動力學(xué)模擬及點突變實驗表明,該復(fù)合物的HNH和RuvC核酸酶活性中心的催化氨基酸可以與DNA解旋單鏈形成切割反應(yīng)所需構(gòu)象。因此,研究獲得的復(fù)合物結(jié)構(gòu)是CRISPR-Cas9的DNA剪切激活構(gòu)象,為全面揭示剪切機(jī)理提供了關(guān)鍵的活性結(jié)構(gòu)信息,并為應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)優(yōu)化該系統(tǒng)、降低其脫靶效應(yīng)提供了重要的結(jié)構(gòu)生物化學(xué)基礎(chǔ)。目前,研究團(tuán)隊正在所得結(jié)構(gòu)的指導(dǎo)下,應(yīng)用蛋白質(zhì)設(shè)計方法對CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化,以開發(fā)脫靶效應(yīng)低、編輯效率高的新型基因編輯系統(tǒng)。

據(jù)悉,博士研究生懷聰和碩士研究生李干為論文的并列第一作者,黃強(qiáng)教授與盧大儒教授為并列通訊作者。研究團(tuán)隊利用國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心 (上海) 的電鏡平臺采集了冷凍電鏡圖像,并主要使用課題組自己建立的電鏡圖像分析與分子建模平臺完成了三維重構(gòu)和原子模型構(gòu)建工作。有關(guān)研究項目獲得了國家自然科學(xué)基金等項目支持。


作者:黃辛?? 文章來源:科學(xué)網(wǎng) www.sciencenet.cn

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