文章來源：解螺旋·醫(yī)生科研助手
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·導(dǎo)語·
好的引物會讓PCR實(shí)驗(yàn)成功一半，因而，引物設(shè)計(jì)一直都是PCR非常重要的環(huán)節(jié)。PrimerPremier5和Oligo7這兩款軟件想必是備受科研汪們推崇的引物設(shè)計(jì)軟件。可是對于懶癌晚期的小魚而言，下載這兩款軟件也是一件非常麻煩的事情。有木有比這兩款軟件更簡單粗暴的引物獲取方法呢？在這里小魚特地給大家推薦3款簡單實(shí)用的在線PCR引物設(shè)計(jì)軟件，讓你分分鐘搞定PCR引物。
No.1 ：NCBI的Primer-Blast
推薦指數(shù)：五顆星
理由：這個(gè)工具整合了目前流行的Primer3軟件，且加上NCBI的Blast進(jìn)行引物特異性的驗(yàn)證；可以針對某一特定剪接變異體基因來設(shè)計(jì)引物。
網(wǎng)址鏈接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/或者直接從Blast主頁（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）上找到。
Primer-Blast的界面包括4個(gè)部分：PCRTemplate（模板區(qū)），Primer Parameters（引物區(qū)），Exon/intron Selection（外顯子內(nèi)含子設(shè)置）和specificity check（特異性驗(yàn)證區(qū)）。
1、設(shè)計(jì)引物
2、驗(yàn)證引物好壞
3、外顯子內(nèi)含子（Exon/intron）
如果設(shè)計(jì)的引物是跨內(nèi)含子和外顯子的交界處，可在此處設(shè)置成為Primer must span an exon-exon junction。外顯子的匹配堿基數(shù)和內(nèi)含子的長度等設(shè)置一般選擇默認(rèn)。
4、特異性（Specificitycheck）
在specificity check區(qū)，選擇設(shè)計(jì)引物或驗(yàn)證引物時(shí)的目標(biāo)數(shù)據(jù)庫和物種。這一步是比較重要的。
這里提供了7種數(shù)據(jù)庫：
RefSeq mRNA，Genome (referenceassemblies from selected organisms)，RefSeqrepresentative genomes，RefSeq RNA(refseq_rna)，nr (the standard non-redundant database)，Genome (chromosomesfrom all organisms)和custom。
前兩個(gè)數(shù)據(jù)庫是經(jīng)過專家注釋的數(shù)據(jù)，這樣可以給出更準(zhǔn)確的結(jié)果。特別是，當(dāng)你用NCBI的參考序列作為模板和參考序列數(shù)據(jù)庫作為標(biāo)準(zhǔn)來設(shè)計(jì)引物時(shí)，Primer-BLAST可以設(shè)計(jì)出只擴(kuò)增某一特定剪接變異體基因的特異引物。
最后建議用oligo6或primer5驗(yàn)證引物自身的特性：發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物自身二聚體、錯(cuò)配和引物間二聚體，△G的絕對值。
No.2 ：Primer3 Plus
推薦指數(shù)：五顆星
理由：嚴(yán)格的qPCR引物設(shè)計(jì)一般要求其中一條引物要跨外顯子，最好在3‘端設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物的長度在300bp以內(nèi)等。本在線軟件可滿足qPCR引物設(shè)計(jì)的要求。
網(wǎng)址鏈接：http://www.primer3plus.com/
1、選擇Run latest Versionof Primer3Plus，就進(jìn)入了設(shè)計(jì)引物的主頁面，合理的使用<>，［］，｛｝符號使引物設(shè)計(jì)符合自己的要求，大家可以在具體實(shí)戰(zhàn)中，深入體會這幾個(gè)符號帶來的方便。
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2、避免多個(gè)重復(fù)堿基出現(xiàn)，避免4個(gè)或超過4個(gè)G出現(xiàn)在引物序列中。按照熒光定量引物要求設(shè)置參數(shù)，如產(chǎn)物長度：不應(yīng)該超過400bp，最好100-150bp；GC％：30％-70%，最好45%－55%；引物長度：18-25bp，最好22-24bp；TM值：58-60℃，最好60℃；3’端：3’端至少4個(gè)堿基保守，最好為T，C，G。
3、點(diǎn)擊右上放綠色按鈕
，可獲得若干對引物，并按照5’到3’的順序，包含了引物和產(chǎn)物的一些基本參數(shù)?？梢愿鶕?jù)熒光定量引物要求，盡量選擇G、C結(jié)尾的引物合成，如下圖中紅框所示，還可以在序列圖中看到引物的位置。
4、設(shè)計(jì)好引物后，我們要進(jìn)行NCBI blast 引物驗(yàn)證，進(jìn)入http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
5、點(diǎn)擊Basic BLAST中的nucleotideblast選項(xiàng)，在下面框中，按照5’－3’順序，分別輸入上游引物和下游引物，上下游引物之間間隔20個(gè)以上n。
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6、選擇物種數(shù)據(jù)庫，如Human，Mouse或者Others（如果是非人和非小鼠物種）。
7、選擇Somewhat similar sequences(blastn)
8、點(diǎn)擊Algorithm parameters, 在Expect threshold 輸入1000，在Word Size 輸入7。Word size不是字體大小的意思，應(yīng)該理解為讀長，按照7個(gè)一組核苷酸序列放到GeneBank中進(jìn)行比對。
9、點(diǎn)擊BLAST，開始比對，出現(xiàn)結(jié)果。顏色代表得分，選擇引物的原則是：列表中大部分是目的基因，說明引物特異性高；但是可能物種不同，說明該基因在不同物種中保守。
No.3 ：Primerbank
推薦指數(shù)：五顆星
理由：哈佛大學(xué)的一個(gè)qPCR引物數(shù)據(jù)庫，目前有超過20萬條引物，涵蓋了人和小鼠大部分已知的基因。根據(jù)網(wǎng)站上對兩萬多對引物的驗(yàn)證結(jié)果，引物有效率為82.7%。盡量選擇這種驗(yàn)證過的qPCR引物，qPCR品質(zhì)比較有保障。
網(wǎng)址：http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
搜索類型這里，可以根據(jù)GenBank accession、NCBI protein accession、NCBI gene ID、primerbank ID、NCBI gene symbol以及keyword六個(gè)選項(xiàng)進(jìn)行搜索。以小鼠的beta-actin為例。
1、首先，到NCBI上找出β-actin的gene ID，如圖，選擇gene,輸入beta-actin：
點(diǎn)擊右邊的分類musmusculus：
結(jié)果就出來了，小鼠beta-actin的NCBI gene ID是11461，而actb則是小鼠beta-actin的NCBI gene symbol。
2、把11461輸入到primerbank里面試試：
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在這個(gè)結(jié)果上我們可以看到beta-actin的NCBI gene ID、GenBank accession、NCBI protein accession、coding DNA length等信息。
3、若是改輸入beta-actin的NCBI gene symbol：actb，也可以得到相同的結(jié)果，往下拉我們還能看到經(jīng)過驗(yàn)證的引物：
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4、點(diǎn)進(jìn)去可以看到溶解曲線、電泳結(jié)果等信息：
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