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一次編輯數(shù)百種基因!遺傳學(xué)大牛George Church發(fā)布基因編輯新方法

日期: 2018-05-25
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一次編輯數(shù)百種基因!遺傳學(xué)大牛George Church發(fā)布基因編輯新方法

基因編輯技術(shù)幫助人們實(shí)現(xiàn)了“編輯生命”的愿望,但該技術(shù)自身存在的局限性也限制了其廣泛應(yīng)用,此前人們的研究熱情也多集中在編輯的效率、準(zhǔn)確性與安全性,但常規(guī)的基因編輯技術(shù)在一個(gè)反應(yīng)中僅能對(duì)一個(gè)或數(shù)個(gè)基因進(jìn)行操作,且通常會(huì)在基因組中留下額外的不需要的序列修改,在大型研究中,已有的基因編輯技術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足大量不同基因的編輯需求。

為解決上述問題,哈佛大學(xué)George Church教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于CRISPR-Cas9的新型高通量基因編輯方法:guide+donor,該方法可以在單個(gè)釀酒酵母中同時(shí)精確改變數(shù)百個(gè)不同基因,編輯效率達(dá)到80%至100%,還能在生物體內(nèi)選擇特定行為細(xì)胞,進(jìn)行定向基因編輯和修復(fù)。guide+donor除幫助構(gòu)建大型文庫(kù)外,還能進(jìn)行基因功能分析,發(fā)現(xiàn)一些未知的基因突變和功能。

5月21日,相關(guān)研究成果發(fā)表在著名學(xué)術(shù)期刊Nature Biotechnology上,文章題為“High-throughput creation and functional profiling of DNA sequence variant libraries using CRISPR–Cas9 in yeast”。

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George Church教授

人類的基因變異通常是點(diǎn)突變導(dǎo)致,為在不干擾其他潛在變異的情況下重構(gòu)釀酒酵母中的某些變異,CRISPR-Cas9技術(shù)借助sgRNA精確靶向DNA目標(biāo)序列,在Cas9酶切割其靶序列后,在一個(gè)被稱為同源定向重組(HDR)的過程中,借助攜帶目的基因突變的供體模板序列來修復(fù)基因。

研究人員表示,新的研發(fā)策略是將sgRNA、供體模板序列與一個(gè)穩(wěn)定可遺傳的染色體外DNA分子連接起來,組成guide+donor組合,這能在一個(gè)反應(yīng)中構(gòu)建大型變體文庫(kù),同時(shí)將多個(gè)sgRNAs和供體模板大量傳遞到酵母細(xì)胞,還能定向修復(fù)斷裂的DNA雙鏈,并通過NGS技術(shù)識(shí)別被編輯的細(xì)胞。

技術(shù)優(yōu)勢(shì):


在一個(gè)反應(yīng)中快速構(gòu)建大型DNA變異文庫(kù)


在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)提供guide和donor,防止無效修復(fù)和非生產(chǎn)性修復(fù)。

含有g(shù)uide+donor組合的質(zhì)粒可以作為追蹤基因編輯細(xì)胞的獨(dú)特條形碼,利用NGS技術(shù)可以進(jìn)行高通量分子表型鑒定。


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guide+donor基因組編輯平臺(tái),來源:Nature Biotechnology

在證明過程中,該團(tuán)隊(duì)首先關(guān)注了酵母中編碼DNA解旋酶和修復(fù)酶SGS1的單個(gè)高保守基因序列,然后他們用一種有毒試劑破壞了攜帶guide+donor文庫(kù)的酵母細(xì)胞DNA,然后對(duì)存活細(xì)胞進(jìn)行DNA測(cè)序。最終他們發(fā)現(xiàn)了影響SGS1特征的基因突變,這些特征對(duì)于受損DNA的修復(fù)至關(guān)重要,并且能影響細(xì)胞持續(xù)存活。

隨后,該研究團(tuán)隊(duì)使用guide+donor方法剔除了酵母全基因組中的315個(gè)基因,它們可以編碼分散在整個(gè)基因組中的小型開放閱讀框架(smORF,長(zhǎng)度<100個(gè)氨基酸)。

在檢測(cè)的315個(gè)smORF中,研究人員發(fā)現(xiàn)68個(gè)是在細(xì)胞適應(yīng)性存活中起重要作用,這與傳統(tǒng)ORFs功能認(rèn)知相反,因?yàn)樵谙嗤瑮l件下,307個(gè)ORF中的104個(gè)會(huì)參與細(xì)胞生長(zhǎng)。通過分析這些基因?qū)湍冈诓煌{迫環(huán)境下存活的影響,發(fā)現(xiàn)可以將未明確的基本功能分配到特定的smORF,為基因功能分析打開了新的大門。

Church表示,新的方法不僅能夠更高效、更準(zhǔn)確地在酵母中進(jìn)行高通量“功能基因組學(xué)”研究,還能模擬、檢測(cè)酵母細(xì)胞中與特定性狀或功能紊亂相關(guān)的低頻基因突變,并找出哪些與疾病實(shí)際相關(guān)。此外,該方法除了可以在龐大的基因家族中挖掘新的基因和功能外,還能研究基因組中的非編碼序列,提高我們對(duì)基因調(diào)控和染色體生物學(xué)的理解。

參考文獻(xiàn):

1.Profiling the genome hundreds of variations at a time

2.High-throughput creation and functional profiling of DNA sequence variant libraries using CRISPR–Cas9 in yeast

轉(zhuǎn)自:測(cè)序中國(guó)

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